据南京巴傲得生物科技有限公司2013年9月22日12:00最新数据分析：质粒构建提取步骤由南京巴傲得专家来告诉您。巴傲得生物科技有限公司是专业从事专业IHC试剂盒、质粒构建、最先进的蛋白表达、抗体定制权威机构、proteinA产品。等生命科学研究的专业技术型企业。从事生物技术产品的开发及销售，致力于将巴傲得生物打造成中国乃至世界一流的生物技术产品供应商。咨询热线：025-68037686
质粒的提取
【器材】加样枪、灭菌的Tip头、灭菌的Ep管、离心机
【试剂】灭菌水、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0
【实验步骤】
第一次使用本试剂盒时，请将RNase A1混浊液全部加入到SolutionⅠ中，均匀混合后4℃保存。实验操作前请将Solution Ⅲ置于4℃（或冰上）预冷后使用。
1. 大肠杆菌的培养。 从平板培养基上挑选单菌落接种至1～4 ml 的含有抗生素的液体培养基中，37℃过夜培注）培养液不宜过量，培养液过量时，会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯
度。
2. 取菌液，12,000 rpm离心2分钟，弃上清。
3. 用250 μl 的Solution Ⅰ（含RNase A1）充分悬浮细菌沉淀。注）注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器（Vortex）等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4.加入250 μl 的Solution Ⅱ轻轻地上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。注）此步骤不宜超过5 分钟。
5. 加入400 μl的4℃预冷的Solution Ⅲ，轻轻上下翻转混合5～6 次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置5分钟。
6. 室温12,000 rpm 离心10 分钟，取上清。注）此时4℃离心不利于沉淀沉降
7. 将试剂盒中的Spin Column 安置于Collection Tube 上。
8. 将上述操作6 的上清液转移至Spin Column 中，12,000 rpm 离心1 分钟，弃滤液。
9. 将500 μl 的Rinse A 加入Spin Column 中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
10. 将700 μl 的Rinse B 加入Spin Column 中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。注）请确认Rinse B中已经加入了指定体积的100%乙醇。
11. 重复操作步骤
12. 将Spin Column 安置于Collection Tube上，12,000 rpm 离心
13. 将Spin Column 安置于新的1.5 ml 的离心管上，在Spin Column 膜的中央处加入60 μl 的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟注）把灭菌蒸馏水或Elution Buffer 加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
14. 12,000 rpm 离心1 分钟洗脱 DNA。15. DNA经1％琼脂糖凝胶电泳进行检测
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